Νέα μέθοδος του MIT για ταχύτατη επισήμανση πρωτεϊνών

Επαναστατική τεχνολογία για τρισδιάστατους ιστούς

Μια νέα τεχνολογία που αναπτύχθηκε στο MIT επιτρέπει στους επιστήμονες να επισημαίνουν πρωτεΐνες σε εκατομμύρια μεμονωμένα κύτταρα μέσα σε πλήρως άθικτους τρισδιάστατους ιστούς με πρωτοφανή ταχύτητα, ομοιομορφία και ευελιξία. Χρησιμοποιώντας αυτή την τεχνολογία, η ομάδα κατάφερε να επισημάνει πλούσια μεγάλα δείγματα ιστών μέσα σε μία μόνο ημέρα. Στη νέα τους μελέτη που δημοσιεύτηκε στο Nature Biotechnology, οι ερευνητές δείχνουν ότι η ικανότητα να επισημαίνουν πρωτεΐνες με αντισώματα σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων σε μεγάλους ιστούς μπορεί να αποκαλύψει πληροφορίες που παραμένουν κρυφές από άλλες ευρέως χρησιμοποιούμενες μεθόδους επισήμανσης.

Η σημασία της πρωτεϊνικής έκφρασης

Η αποτύπωση των πρωτεϊνών που παράγουν τα κύτταρα είναι θεμελιώδης για μελέτες στη βιολογία, τη νευροεπιστήμη και συναφείς τομείς, καθώς οι πρωτεΐνες που εκφράζει ένα κύτταρο σε μια δεδομένη στιγμή μπορούν να αντικατοπτρίζουν τις λειτουργίες που προσπαθεί να εκτελέσει ή την αντίδρασή του σε συνθήκες όπως ασθένεια ή θεραπεία. Παρά την πρόοδο στη μικροσκοπία και τις τεχνολογίες επισήμανσης, οι επιστήμονες δεν είχαν μέχρι τώρα έναν αξιόπιστο και πρακτικό τρόπο παρακολούθησης της έκφρασης πρωτεϊνών σε εκατομμύρια πυκνά συσκευασμένα μεμονωμένα κύτταρα σε ολόκληρους, τρισδιάστατους άθικτους ιστούς.

Η πρόκληση της ομοιομορφίας

Συμβατικά, η διερεύνηση των μορίων εντός των κυττάρων απαιτεί τη διάσπαση του ιστού σε μεμονωμένα κύτταρα ή την κοπή του σε λεπτές τομές, καθώς το φως και τα χημικά που απαιτούνται για την ανάλυση δεν μπορούν να διεισδύσουν βαθιά στους ιστούς. Το εργαστήριο του Kwanghun Chung στο MIT ανέπτυξε τεχνολογίες όπως το CLARITY και το SHIELD, που επιτρέπουν τη διερεύνηση ολόκληρων οργάνων καθιστώντας τα διαφανή, αλλά χρειαζόταν έναν τρόπο να επισημαίνει χημικά ολόκληρα όργανα για να αποκτήσει χρήσιμες επιστημονικές πληροφορίες. Αν τα κύτταρα μέσα σε έναν ιστό δεν επεξεργαστούν ομοιόμορφα, δεν μπορούν να συγκριθούν ποσοτικά.

Η καινοτομία του CuRVE

Η νέα προσέγγιση, που ονομάζεται CuRVE, αντιπροσωπεύει μια σημαντική πρόοδο — χρόνια στην κατασκευή — προς αυτόν τον στόχο, επιδεικνύοντας μια θεμελιωδώς νέα προσέγγιση για την ομοιόμορφη επεξεργασία μεγάλων και πυκνών ιστών στο σύνολό τους. Στη μελέτη, οι ερευνητές εξηγούν πώς ξεπέρασαν τα τεχνικά εμπόδια μέσω μιας εφαρμογής του CuRVE που ονομάζεται eFLASH, και παρέχουν πολυάριθμες ζωντανές επιδείξεις της τεχνολογίας, συμπεριλαμβανομένου του πώς απέδωσε νέες γνώσεις στη νευροεπιστήμη.

Η χημεία πίσω από την τεχνολογία

Ο βασικός λόγος για τον οποίο τα μεγάλα, τρισδιάστατα δείγματα ιστών είναι δύσκολο να επισημανθούν ομοιόμορφα είναι ότι τα αντισώματα διεισδύουν στον ιστό πολύ αργά, αλλά συνδέονται γρήγορα με τις πρωτεΐνες-στόχους τους. Η πρακτική συνέπεια αυτής της αναντιστοιχίας ταχύτητας είναι ότι αν απλά μουλιάσουμε έναν εγκέφαλο σε ένα λουτρό αντισωμάτων, οι πρωτεΐνες θα επισημανθούν έντονα στην εξωτερική άκρη του ιστού, αλλά σχεδόν κανένα από τα αντισώματα δεν θα βρει κύτταρα και πρωτεΐνες βαθύτερα μέσα.

Η υλοποίηση του eFLASH

Για να βελτιώσουν την επισήμανση, η ομάδα συνέλαβε έναν τρόπο — την εννοιολογική ουσία του CuRVE — να επιλύσει την αναντιστοιχία ταχύτητας. Η στρατηγική ήταν να ελέγχουν συνεχώς τον ρυθμό σύνδεσης των αντισωμάτων ενώ ταυτόχρονα επιταχύνουν τη διείσδυση των αντισωμάτων σε όλο τον ιστό. Για να κατανοήσουν πώς αυτό θα μπορούσε να λειτουργήσει και να βελτιστοποιήσουν την προσέγγιση, δημιούργησαν και εκτέλεσαν μια προηγμένη υπολογιστική προσομοίωση που τους επέτρεψε να δοκιμάσουν διαφορετικές ρυθμίσεις και παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένων διαφορετικών ρυθμών σύνδεσης και πυκνοτήτων και συνθέσεων ιστού.

Επιταχύνοντας τη διαδικασία

Εν τω μεταξύ, για να επιταχύνουν την κίνηση των αντισωμάτων μέσω των ιστών, η ομάδα χρησιμοποίησε μια άλλη προηγούμενη τεχνολογία που εφευρέθηκε στο εργαστήριο του Chung: τη στοχαστική ηλεκτρομεταφορά. Αυτή η τεχνολογία επιταχύνει τη διασπορά των αντισωμάτων μέσω του ιστού εφαρμόζοντας ηλεκτρικά πεδία. Η υλοποίηση αυτού του συστήματος eFLASH με επιταχυμένη διασπορά και συνεχώς τροποποιήσιμη ταχύτητα σύνδεσης απέδωσε την ευρεία ποικιλία επιτυχιών επισήμανσης που επιδεικνύονται στο άρθρο.

Σημαντικές οπτικοποιήσεις

Μεταξύ των τρόπων που η ομάδα έθεσε το eFLASH στη δοκιμή ήταν συγκρίνοντας την επισήμανσή τους με μια άλλη συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδο: τη γενετική τροποποίηση των κυττάρων ώστε να φθορίζουν όταν το γονίδιο μιας πρωτεΐνης ενδιαφέροντος μεταγράφεται. Η γενετική μέθοδος δεν απαιτεί τη διασπορά αντισωμάτων σε όλο τον ιστό, αλλά μπορεί να είναι επιρρεπής σε διαφορές, καθώς η αναφορά της μεταγραφής γονιδίων και η πραγματική παραγωγή πρωτεϊνών δεν είναι ακριβώς το ίδιο πράγμα.

Συμπεράσματα και προοπτικές

Οι ερευνητές δεν σκοπεύουν να υποτιμήσουν την αξία της χρήσης των γενετικών μεθόδων αναφοράς, αλλά προτείνουν ότι η χρήση της οργανο-ευρείας επισήμανσης με αντισώματα, όπως επιτρέπει το eFLASH, μπορεί να βοηθήσει να τοποθετηθούν αυτά τα δεδομένα σε ένα πλουσιότερο, πιο πλήρες πλαίσιο. Η ανακάλυψή τους για τη μεγάλη περιφερειακή απώλεια νευρώνων που αντιδρούν στο PV σε υγιή ενήλικα ποντίκια, με υψηλή ατομική μεταβλητότητα, τονίζει τη σημασία της ολιστικής και αμερόληπτης φαινοτυπικής ανάλυσης.

Εκτός από τον Yun, τον Park και τον Chung, οι άλλοι συγγραφείς του άρθρου είναι οι Jae Hun Cho, Lee Kamentsky, Nicholas Evans,