Καινοτόμο εργαλείο γονιδιακής θεραπείας από το MIT

Η επανάσταση της γονιδιακής επεξεργασίας

Ερευνητές από το Ινστιτούτο McGovern για Έρευνα του Εγκεφάλου στο MIT και το Broad Institute του MIT και του Harvard έχουν αναπτύξει ένα νέο, συμπαγές ένζυμο καθοδηγούμενο από RNA, το οποίο μετατρέπεται σε αποτελεσματικό και προγραμματιζόμενο εργαλείο επεξεργασίας του ανθρώπινου DNA. Το πρωτεϊνικό αυτό εργαλείο, που ονομάζεται NovaIscB, μπορεί να προσαρμοστεί για να επιφέρει ακριβείς αλλαγές στον γενετικό κώδικα, να ρυθμίσει τη δραστηριότητα συγκεκριμένων γονιδίων ή να εκτελέσει άλλες εργασίες επεξεργασίας. Η μικρή του διάσταση διευκολύνει την παράδοσή του στα κύτταρα, καθιστώντας το υποσχόμενο υποψήφιο για την ανάπτυξη γονιδιακών θεραπειών για την αντιμετώπιση ή την πρόληψη ασθενειών.

Η προέλευση και η εξέλιξη του NovaIscB

Η πρωτεΐνη NovaIscB προέρχεται από ένα βακτηριακό κόπτη DNA που ανήκει στην οικογένεια πρωτεϊνών IscBs, την οποία ανακάλυψε το εργαστήριο του Zhang το 2021. Οι IscBs είναι ένα είδος συστήματος OMEGA, οι εξελικτικοί πρόγονοι του Cas9, που αποτελεί μέρος του βακτηριακού συστήματος CRISPR. Όπως το Cas9, τα ένζυμα IscB κόβουν το DNA σε θέσεις που καθορίζονται από έναν οδηγό RNA. Με την επαναπρογραμματισμό αυτού του οδηγού, οι ερευνητές μπορούν να κατευθύνουν τα ένζυμα σε επιθυμητές αλληλουχίες.

Η πρόκληση της βελτίωσης της δραστηριότητας

Τα IscBs τράβηξαν την προσοχή της ομάδας όχι μόνο επειδή μοιράζονται βασικά χαρακτηριστικά με το Cas9, αλλά και επειδή είναι το ένα τρίτο του μεγέθους του. Αυτό αποτελεί πλεονέκτημα για πιθανές γονιδιακές θεραπείες: τα συμπαγή εργαλεία είναι πιο εύκολα στη μεταφορά στα κύτταρα, και με ένα μικρό ένζυμο, οι ερευνητές έχουν περισσότερη ευελιξία να προσθέσουν νέες λειτουργίες χωρίς να δημιουργούν εργαλεία που είναι πολύ ογκώδη για κλινική χρήση.

Η στρατηγική μηχανική του NovaIscB

Για να ξεκινήσουν τη διαδικασία μηχανικής, η μεταπτυχιακή φοιτήτρια Soumya Kannan και ο μεταδιδακτορικός ερευνητής Shiyou Zhu αναζήτησαν πρώτα ένα IscB που θα αποτελούσε καλή αφετηρία. Δοκίμασαν σχεδόν 400 διαφορετικά ένζυμα IscB που βρίσκονται σε βακτήρια. Δέκα από αυτά ήταν ικανά να επεξεργαστούν το DNA σε ανθρώπινα κύτταρα.

Η ισορροπία μεταξύ δραστηριότητας και εξειδίκευσης

Ακόμη και τα πιο ενεργά από αυτά τα ένζυμα θα έπρεπε να ενισχυθούν για να γίνουν χρήσιμα εργαλεία γονιδιακής επεξεργασίας. Η πρόκληση ήταν να αυξηθεί η δραστηριότητα του ενζύμου, αλλά μόνο στις αλληλουχίες που καθορίζονται από τον οδηγό RNA του. Αν το ένζυμο γινόταν πιο ενεργό, αλλά χωρίς διάκριση, θα έκοβε το DNA σε ανεπιθύμητα σημεία. “Το κλειδί είναι να ισορροπήσουμε τη βελτίωση της δραστηριότητας και της εξειδίκευσης ταυτόχρονα,” εξηγεί ο Zhu.

Η εξέλιξη και η προσαρμογή του NovaIscB

Για να βελτιστοποιήσουν το IscB για την επεξεργασία του ανθρώπινου γονιδιώματος, η ομάδα αξιοποίησε πληροφορίες που είχε αποκτήσει ο μεταπτυχιακός φοιτητής Han Altae-Tran σχετικά με την ποικιλομορφία των βακτηριακών IscBs και την εξέλιξή τους. Οι ερευνητές παρατήρησαν ότι τα IscBs που λειτουργούσαν σε ανθρώπινα κύτταρα περιλάμβαναν ένα τμήμα που ονόμασαν REC, το οποίο απουσίαζε από άλλα IscBs. Υπέθεσαν ότι το ένζυμο μπορεί να χρειάζεται αυτό το τμήμα για να αλληλεπιδρά με το DNA σε ανθρώπινα κύτταρα.

Η χρήση της τεχνητής νοημοσύνης στην ανάπτυξη

Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, η ομάδα πειραματίστηκε με την αντικατάσταση τμημάτων των REC domains από διαφορετικά IscBs και Cas9s, αξιολογώντας πώς κάθε αλλαγή επηρέασε τη λειτουργία της πρωτεΐνης. Καθοδηγούμενοι από την κατανόησή τους για το πώς τα IscBs και τα Cas9s αλληλεπιδρούν με το DNA και τους οδηγούς RNA τους, οι ερευνητές έκαναν πρόσθετες αλλαγές, με στόχο τη βελτιστοποίηση τόσο της αποτελεσματικότητας όσο και της εξειδίκευσης.

Η επιτυχία του NovaIscB

Τελικά, δημιούργησαν μια πρωτεΐνη που ονόμασαν NovaIscB, η οποία ήταν πάνω από 100 φορές πιο ενεργή σε ανθρώπινα κύτταρα από το αρχικό IscB, και είχε δείξει καλή εξειδίκευση για τους στόχους της. Η Kannan και ο Zhu κατασκεύασαν και εξέτασαν εκατοντάδες νέες IscBs πριν καταλήξουν στο NovaIscB — και κάθε αλλαγή που έκαναν στην αρχική πρωτεΐνη ήταν στρατηγική. Οι προσπάθειές τους καθοδηγήθηκαν από τη γνώση της φυσικής εξέλιξης των IscBs, καθώς και από προβλέψεις για το πώς κάθε αλλαγή θα επηρεάσει τη δομή της πρωτεΐνης, χρησιμοποιώντας ένα εργαλείο τεχνητής νοημοσύνης που ονομάζεται AlphaFold2.

Η εφαρμογή και οι προοπτικές του NovaIscB

Η ομάδα απέδειξε ότι το NovaIscB είναι μια καλή βάση για μια ποικιλία εργαλείων γονιδιακής επεξεργασίας. “Λειτουργεί βιοχημικά πολύ παρόμοια με το Cas9, και αυτό το καθιστά εύκολο να μεταφερθούν εργαλεία που είχαν ήδη βελτιστοποιηθεί με τη βάση του Cas9,” λέει η Kannan. Με διαφορετικές τροποποιήσεις, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν το NovaIscB για να αντικαταστήσουν συγκεκριμένα γράμματα του κώδικα DNA σε ανθρώπινα κύτταρα και να αλλάξουν τη δραστηριότητα στοχευμένων γονιδίων.

Η κλινική εφαρμογή και το μέλλον

Σημαντικά, τα εργαλεία που βασίζονται στο NovaIscB είναι αρκετά συμπαγή ώστε να συσκευάζονται εύκολα μέσα σε έναν μόνο αδενο-συνδεδεμένο ιό (AAV) — το πιο κοινώς χρησιμοποιούμενο φορέα για την ασφαλή παράδοση γονιδιακής θεραπείας σε ασθενείς. Επειδή είναι πιο ογκώδη, τα εργαλεία που αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το Cas9 μπορεί να απαιτούν μια πιο περίπλοκη στρατηγική παράδοσης.

Αποδεικνύοντας τη θεραπευ