Επαναστατικές εξελίξεις στην επεκτατική μικροσκοπία

Η νέα εποχή της βιολογικής απεικόνισης

Στον τομέα της βιολογίας, η ικανότητα να βλέπουμε με ακρίβεια οδηγεί σε βαθύτερη κατανόηση. Στο εργαστήριο του καθηγητή Edward Boyden στο Ινστιτούτο McGovern για την Έρευνα του Εγκεφάλου, οι ερευνητές εργάζονται ακούραστα για να φέρουν τη ζωή σε πιο ευκρινή εστίαση. Με δύο νέες μεθόδους, επεκτείνουν τις δυνατότητες της επεκτατικής μικροσκοπίας — μιας τεχνικής απεικόνισης υψηλής ανάλυσης που εισήγαγαν το 2015 — ώστε οι ερευνητές παντού να μπορούν να βλέπουν περισσότερα όταν εξετάζουν κύτταρα και ιστούς υπό το φως ενός μικροσκοπίου.

Ο στόχος του Boyden, καθηγητή Νευροτεχνολογίας στο MIT, είναι να δημιουργήσει ένα στιγμιότυπο όλης της ζωής, μέχρι τα θεμελιώδη δομικά της στοιχεία. «Θέλουμε να βλέπουμε τα πάντα, γι’ αυτό προσπαθούμε συνεχώς να το βελτιώνουμε», αναφέρει. Ο Boyden είναι επίσης ερευνητής του Howard Hughes Medical Institute και μέλος του Yang Tan Collective στο MIT.

Η τεχνική της επεκτατικής μικροσκοπίας

Με νέους τρόπους χρώσης των δειγμάτων και επεξεργασίας των εικόνων, οι χρήστες της επεκτατικής μικροσκοπίας μπορούν τώρα να δουν ζωντανά περιγράμματα των σχημάτων των κυττάρων και να εντοπίσουν τις θέσεις πολλών διαφορετικών πρωτεϊνών μέσα σε ένα μόνο δείγμα ιστού με ανάλυση που υπερβαίνει κατά πολύ αυτή της συμβατικής φωτεινής μικροσκοπίας. Αυτές οι εξελίξεις, που αναφέρθηκαν σε ανοιχτή πρόσβαση στο περιοδικό Nature Communications, επιτρέπουν νέους τρόπους ανίχνευσης των λεπτών προεκτάσεων των νευρώνων και απεικόνισης των χωρικών σχέσεων μεταξύ μορίων που συμβάλλουν στην υγεία και την ασθένεια.

Η επεκτατική μικροσκοπία χρησιμοποιεί ένα υδρογέλη που απορροφά νερό για να επεκτείνει φυσικά τους βιολογικούς ιστούς. Αφού ένα δείγμα ιστού έχει διαπεραστεί από το υδρογέλη, ενυδατώνεται, και το υδρογέλη διογκώνεται καθώς απορροφά νερό, διατηρώντας τις σχετικές θέσεις των μορίων στον ιστό καθώς τα απομακρύνει απαλά το ένα από το άλλο. Ως αποτέλεσμα, τα πυκνά κυτταρικά συστατικά εμφανίζονται ξεχωριστά και διακριτά όταν ο επεκταμένος ιστός προβάλλεται υπό το φως ενός μικροσκοπίου. Η προσέγγιση, που μπορεί να πραγματοποιηθεί με χρήση τυπικού εργαστηριακού εξοπλισμού, έχει καταστήσει την απεικόνιση υπερ-υψηλής ανάλυσης προσβάσιμη στις περισσότερες ερευνητικές ομάδες.

Οπτικοποίηση μεμβρανών κυττάρων

Ένα από τα τελευταία επιτεύγματα της ομάδας είναι η μέθοδος που ονομάζεται ultrastructural membrane expansion microscopy (umExM), η οποία περιγράφεται στην έκδοση της 12ης Φεβρουαρίου του Nature Communications. Με αυτήν, οι βιολόγοι μπορούν να χρησιμοποιήσουν την επεκτατική μικροσκοπία για να οπτικοποιήσουν τις λεπτές μεμβράνες που σχηματίζουν τα όρια των κυττάρων και περιβάλλουν τα οργανίδια τους. Αυτές οι μεμβράνες, που κατασκευάζονται κυρίως από μόρια που ονομάζονται λιπίδια, ήταν γνωστό ότι είναι δύσκολο να χρωματιστούν πυκνά σε άθικτους ιστούς για απεικόνιση με φωτεινή μικροσκοπία. Τώρα, οι ερευνητές μπορούν να χρησιμοποιήσουν το umExM για να μελετήσουν την κυτταρική υπερδομή και οργάνωση μέσα στους ιστούς.

Ο Tay Shin, πρώην μεταπτυχιακός φοιτητής στο εργαστήριο του Boyden και συνεργάτης στο Tan-Yang Center for Autism Research στο MIT, ηγήθηκε της ανάπτυξης του umExM. «Ο αρχικός μας στόχος ήταν απλός: Ας χρωματίσουμε τις μεμβράνες σε άθικτο ιστό, όπως κάνει ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο με το οσμικό τετροξείδιο για να οπτικοποιήσει τις μεμβράνες στον ιστό», λέει. «Αποδείχθηκε ότι είναι εξαιρετικά δύσκολο να επιτευχθεί αυτό.»

Η πρόκληση της επισήμανσης των μεμβρανών

Η ομάδα έπρεπε πρώτα να σχεδιάσει μια ετικέτα που θα έκανε τις μεμβράνες σε δείγματα ιστού ορατές υπό το φως ενός μικροσκοπίου. «Σχεδόν έπρεπε να ξεκινήσουμε από το μηδέν», αναφέρει ο Shin. «Πραγματικά έπρεπε να σκεφτούμε τα θεμελιώδη χαρακτηριστικά του ανιχνευτή που θα χρωματίσει την πλασματική μεμβράνη και στη συνέχεια να σκεφτούμε πώς να τα ενσωματώσουμε στην επεκτατική μικροσκοπία.» Αυτό σήμαινε την κατασκευή ενός μορίου που θα συνδέεται με τα λιπίδια που αποτελούν τη μεμβράνη και θα το συνδέει τόσο με το υδρογέλη που χρησιμοποιείται για την επέκταση του δείγματος ιστού όσο και με ένα φθορίζον μόριο για ορατότητα.

Μετά από βελτιστοποίηση του πρωτοκόλλου επεκτατικής μικροσκοπίας για την οπτικοποίηση των μεμβρανών και εκτεταμένες δοκιμές και βελτιώσεις των πιθανών ανιχνευτών, ο Shin βρήκε επιτυχία ένα βράδυ στο εργαστήριο. Τοποθέτησε ένα επεκταμένο δείγμα ιστού σε ένα μικροσκόπιο και είδε καθαρά περιγράμματα κυττάρων.

Εφαρμογές και δυνατότητες

Χάρη στην υψηλή ανάλυση που επιτρέπει η επέκταση, η μέθοδος επέτρεψε στην ομάδα του Boyden να εντοπίσει ακόμη και τους μικροσκοπικούς δενδρίτες που προεξέχουν από τους νευρώνες και να δει καθαρά τις μακριές επεκτάσεις των λεπτών αξόνων τους. Αυτού του είδους η καθαρότητα θα μπορούσε να βοηθήσει τους ερευνητές να ακολουθήσουν τις διαδρομές μεμονωμένων νευρώνων μέσα στα πυκνά διασυνδεδεμένα δίκτυα του εγκεφάλου, λένε οι ερευνητές.

Ο Boyden αποκαλεί την ανίχνευση αυτών των νευρικών διεργασιών «προτεραιότητα της εποχής μας στην επιστήμη του εγκεφάλου». Η ανίχνευση αυτή παραδοσιακά βασιζόταν σε μεγάλο βαθμό στην ηλεκτρονική μικροσκοπία, η οποία απαιτεί εξειδικευμένες δεξιότητες και ακριβό εξοπλισμό. Ο Shin αναφέρει ότι επειδή η επεκτατική μικροσκοπία χρησιμοποιεί ένα τυπικό φωτεινό μικροσκόπιο, είναι πολύ πιο προσιτή στα εργαστήρια παγκοσμίως.

Ο Shin και ο Boy